Introducción
El diagnostico histopatológico es ampliamente practicado además de los pruebas clínicas para el diagnostico de enfermedades renales. En la metodología establecida, el tejido renal obtenido de la biopsia se corta en tres trozos, dos de ellos son pequeños y se procesan por examen por microscopia inmunofluorescente y por microcopia electrónica de transmisión (TEM). El trozo restante es incorporado en parafina y se corta finamente, se prepara una muestra teñida para microscopia óptica (LM) y se examinan los cambios histológicos. La información obtenida de estas tres metodologías se consolida para el diagnóstico patológico de la biopsia renal.
La microscopia de transmisión electrónica (TEM) se usa ampliamente para el examen del tejido renal, pero el uso de la microscopía electrónica de barrido (SEM) para el examen de la biopsia renal ha permanecido en gran parte sin explorar. Los informes sobre su uso para muestras de biopsia son escasos y generalmente se limitan a estudios de investigación, debido a la complejidad de la preparación de la muestra y la información restringida sobre las imágenes de las superficies de los tejidos.
Con el reciente desarrollo del microscopio electrónico de barrido de vacío de mesa (LV-SEM), se ha investigado un nuevo método de observación utilizando sus niveles de aumento y resolución, que son sustancialmente más altos que los de microscopia óptica. Esta nueva tecnología LV-SEM permite una observación directa de muestras montadas en portaobjetos sin tratamiento adicional, y también brinda la posibilidad de examen histopatológico en nivel 3D de acuerdo con el espesor de la muestra. El establecimiento del método de examen con LV-SEM promete mejorar la calidad del diagnóstico patológico. A continuación, presentamos algunos de los resultados de nuestra investigación sobre el examen de muestras de biopsia renal mediante el uso de LV-SEM, que pueden servir como referencia para un mayor progreso.
Observación de muestras LM por LV-SEM
El microscopio TM3030 desarrollado por Hitachi High-Tech Corporation, tiene un tamaño compacto, facilidad de operación y no requiere de un cuarto oscuro, este tiene las funciones generales de un microscopio SEM y proporciona aumentos de observación de muestra de hasta 60,000 x, aunque actualmente el modelo TM4000 permite aumentos hasta X100,000. El microscopio TM3030 consta de una pequeña bomba de vacío, una unidad SEM para colocarla sobre una mesa, una computadora para el control operativo de la muestra y la visualización de la imagen de observación, además funciona con una fuente de alimentación normal de 100V/110V.
Fig.1 Configuración SEM de bajo vacío (LV-SEM)
Al observar las propiedades de bajo vacío de este SEM, el Dr. Sumire Inaga, del Departamento de Anatomía de la Facultad de Medicina de la Universidad de Tottori, estableció una metodología de transformación simplemente colocando una muestra sobre portaobjetos de vidrio ordinaria en la cámara de muestras LV-SEM. El tejido sin un cubreobjetos es teñido y puede ser examinado irradiándolo con un haz de electrones en el modo de electrones retrodispersados (BSE) y observando la imagen SEM resultante.
Para el examen de biopsia renal, la práctica estándar se ha convertido en observar muestras teñidas con tinciones HE (hematoxylin-eosin), PAS y Masson (o AZAN) más tinción de impregnación de plata, tinción de ácido periódico y plata metanamina (tinción PASM). El procedimiento de tinción PASM expone los grupos aldehído oxidando el polisacárido-proteína, que es el componente principal de la membrana basal y otras partes de la matriz extracelular. Al reaccionar esto con tinciones de plata, la región de unión de plata se vuelve marrón oscuro, lo que hace que los componentes celulares negativos a la plata y los componentes de la matriz extracelular positivos a la plata se distingan claramente. La tinción HE generalmente se agrega como contra tinción para obtener la muestra PASM-HE. De esta manera, la información se deriva tanto de HE como de tinción con plata. El método es muy eficaz para observar muestras con el microscopio óptico. La tinción PASM-HE se ha utilizado ampliamente en el examen patológico de muestras de biopsia de riñón.
Fig.2 Envío de la muestra LM a LV-SEM
La tinción con platino para metales pesados es denominada tinción “azul de platino” se caracteriza por la especificidad del tejido celular y el fortalecimiento efectivo de las señales de electrones retro dispersados, que facilitan la observación de secciones de tejido incluidas en parafina mediante LV-SEM. La tinción con la solución de azul de platino después de la des parafinización de una sección delgada de parafina sin teñir en un portaobjetos de vidrio da como resultado una visualización clara de la estructura celular de la muestra LM en la observación por LV-SEM. De esta manera, la imagen teñida con azul platino proporciona una visualización clara de los componentes celulares y otros constituyentes, mientras que la imagen teñida con PASM visualiza claramente la membrana basal plateada positiva y otros constituyentes. Estas características de tinción son mutuamente complementarias. Con cortes sucesivos de tejido incluido en parafina para muestras teñidas con PASM y teñidas con azul platino y la combinación de imágenes LV-SEM de ambas, se puede examinar de cerca la imagen estructural ultrafina de las lesiones tisulares en la misma posición (Fig.3).
Fig.3 Tinciones PASM y azul platino
En las tinciones PASM (izquierda), componentes plateados positivos de la membrana basal y otros constituyentes, complementados con la tinción clara de azul platino de los componentes celulares (derecha; figura del Dr. Sumire Inaga). GBM: membrana basal; L: lumen vascular; M: célula mesangial; E: célula endotelial; P: podocito.
Observación de biopsia renal
Las muestras teñidas con PASM, que se utilizan habitualmente en el diagnóstico de biopsia renal, pueden observarse directamente mediante LV-SEM. La diferencia entre las imágenes LM y LV-SEM se puede ver fácilmente comparando una imagen LM de baja magnificación que muestra una muestra completa de biopsia renal teñida con PASM y una imagen LV-SEM de la misma muestra con el mismo aumento (Fig.4 ). Es imposible comparar las imágenes TEM con las obtenidas por LM de las mismas muestras de biopsia, pero LV-SEM permite la observación de exactamente las mismas regiones que las de la observación LM. Esta capacidad es muy significativa y abre el camino a un mayor nivel de precisión en el análisis de lesiones intratisulares. LV-SEM también permite la observación de cualquier región en la muestra de tejido LM con cualquier aumento elegido, lo que aumenta aún más su eficacia. El aumento más alto disponible con LM es de aproximadamente 600 ×, o 1000 × con una lente de inmersión en aceite. Con LV-SEM, la misma región se puede ampliar hasta 30.000 × a 60.000 ×. Aún más importante es la extraordinaria precisión proporcionada por su resolución de 5 nm (con estándar de oro), en comparación con la resolución de 200 nm proporcionada por LM. Su capacidad para proporcionar información 3D sobre todo el grosor de la muestra contribuye aún más a una percepción clara y detallada de la lesión.
Fig.4 Comparación de imágenes de tejido obtenidas por LM y LV-SEM del mismo portaobjetos LM.
Estas capacidades del LV-SEM a menudo pueden mostrar claras anomalías en la observación de las mismas regiones donde la microscopía óptica para muestras teñidas con PASM no puede. La figura 5, de un caso con hematuria, muestra los hallazgos de una región en la que el LM con 600X aumento, indistintamente muestra la presencia de una anomalía, mientras que la observación 3D a mayor aumento por LV-SEM confirma claramente que se trata de una pequeña rotura la membrana basal a la que se le escapa una célula sanguínea.
Fig.5 Suministro de información de alta precisión por LV-SEM
Conclusiones
LV-SEM se puede utilizar eficazmente para observar muestras de microscopía óptica de biopsia renal y cualquier otro tejido con la selección de tinción adecuada. Su aplicación bien puede extenderse a la situación en la que el examen de tejidos mediante microscopios electrónicos de transmisión habituales no está disponible, en el caso de un tumor difícil de diagnosticar en el examen LM habitual, y muchas otras circunstancias que necesitan información ultramicroscópica.
Con la adopción cada vez mayor de LV-SEM, también surgirán nuevas técnicas de tinción, además de la tinción con azul de platino y la tinción con plata PASM, y el desarrollo de aplicaciones se extenderá al diagnóstico cito patológico, el análisis rápido para satisfacer necesidades urgentes y otros requisitos. Servirá como una contribución importante para mejorar la precisión en el diagnóstico de tejidos patológicos.
El desarrollo práctico del diagnóstico mediante el examen por microscopía electrónica de barrido LV-SEM con muestras de microscopía óptca LM requerirá estudios comparativos de imágenes LV-SEM con imágenes LM y TEM para las mismas muestras. Se debe establecer la construcción de una gran base de datos para consolidar sus hallazgos y los resultados de los exámenes para varios tipos de lesiones. La metodología LV-SEM se originó en Japón, pero este estudio y su adopción generalizado requerirán muchos trabajos cooperativos a través de muchos países.
Aplicación tomado y traducido de :
https://www.hitachi-hightech.com/global/sinews/si_report/090202/